摘要：目的观察益气化湿通络方对慢性肾功能衰竭（CRF）大鼠炎症及纤维化的改善作用，并探讨其可能的分子机制。方法用Platt法制备CRF大鼠模型，将造模成功的24只SD雄性大鼠分为模型组、益气化湿通络方组和贝那普利组，每组8只，同时设假手术组（8只）。观察大鼠血生化指标血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）及通过HE和天狼星红染色观察残肾组织病理改变；通过实时荧光定量PCR检测FNmRNA表达水平；Westernblotting技术观察大鼠肾组织核转录因子-κB（NF-κB）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、纤维连接蛋白（FN）蛋白表达情况；免疫组化法观察FN蛋白表达情况，免疫荧光法观察NF-κB蛋白的表达情况。结果模型组大鼠Scr、BUN水平升高，病理改变呈现明显的炎症浸润及胶原沉积，NF-κB、ICAM-1、TGF-β1、FN蛋白表达水平增高。经益气化湿通络方及贝那普利干预后Scr、BUN值降低，炎症减少，胶原沉积减少，NF-κB、ICAM-1、TGF-β1、FN蛋白表达减少。结论益气化湿通络方改善了CRF模型大鼠的肾功能，通过调节NF-κB通路和TGF-β1蛋白水平减缓残存肾脏炎症及纤维化的病理进程。
慢性肾功能衰竭（chronicrenalfailure，CRF）是各种慢性肾脏疾病（chronickidneydisease，CKD）的共同结局，已成为我国重要的公共卫生问题[1]。CRF的病理演化过程是多种因素引起肾小球和肾小管的损伤，持续损伤造成肾组织萎缩、纤维化，最终进展为CRF。越来越多的证据表明炎症在CRF的进展中起着重要的作用[2]。炎症开始是多种肾脏损伤的保护性反应；然而，持续的炎症刺激物可活跃成纤维细胞促进肾成纤维原基因表达和进展性肾纤维化[3]。大量报道提示核转录因子-κB（NF-κB）信号通路对巨噬细胞浸润和炎症的调节具有重要作用[4]。因此调节NF-κB信号通路可以起到控制炎症反应进而延缓CRF进展的作用。本实验旨在探讨在5/6肾切除大鼠CRF的模型中NF-κB信号通路和转化生长因子-β1（TGF-β1）与CRF炎症、纤维化进程的关系及益气化湿通络方治疗CRF可能的分子机制。
中医药有着几千年的历史，临床应用有着可靠和有益的治疗效果[5-7]。目前，中医学界对CRF炎症与纤维化反应临床表现出的症状辨证，认识到CRF基本病机是气阴两虚、瘀湿阻滞络脉贯穿病程始终。提示CRF瘀湿阻滞肾络与炎性纤维化反应发病学说之间具有一定的相关性[8]。益气化湿通络方治以益气补肾、化湿通络，祛除病理产物，缓解纤维化，有效改善CRF患者症状并延缓其进入透析及肾移植等晚期阶段的进程[9]。本研究旨在探讨益气化湿通络方是否是通过调控炎症反应，改善CRF大鼠的肾功能及纤维化，并阐明此方对CRF产生治疗作用可能的分子机制。
1材料
1.1动物
SPF级健康雄性SD大鼠60只，体质量（±20）g，购自北京维通利华实验动物有限公司，合格证号SCXK（京）-。大鼠分笼饲养于河北中医学院实验动物中心，大鼠自由饮水和进食，进食标准普通饲料，12h交替光照。
1.2药物
益气化湿通络方组方药材：*芪（批号）25g、当归（批号）12g、川芎（批号）10g、红花（批号）10g、地龙（批号）10g、水蛭（批号）3g、仙茅（批号）10g、仙灵脾（批号）12g、藿香（批号）6g、佩兰（批号）6g、陈皮（批号）12g、白豆蔻（批号）6g、土茯苓（批号）30g、积雪草（批号）30g，以上药材均为中药颗粒剂（广东一方制药有限公司提供，医院处方）；盐酸贝那普利片（商品名洛丁新，购于北京诺华制药有限公司，批号X）。
1.3试剂与仪器
尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）试剂均购自南京建成生物工程研究所。兔抗大鼠NF-κB、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、TGF-β1、纤维连接蛋白（FN）单克隆一抗购于美国Abcam公司，山羊抗兔二抗由武汉博士德生物公司提供。RNA提取试剂盒、逆转录酶试剂盒、荧光定量试剂盒均购自普洛麦格生物有限公司，引物由上海生物工程有限公司合成。
2方法
2.1动物模型制备
采用Platt法制备5/6肾切除CRF大鼠模型。用10%水合氯醛（3.5mL/kg）ip麻醉大鼠，大鼠俯卧左脊骨旁切口，游离出左肾，弧形切除上下极各1/3肾皮质组织，止血、复位、缝合；1周后切摘整个右肾。假手术组大鼠进行剥离两侧肾包膜操作，不切除肾脏。造模成功的模型大鼠24只，假手术组大鼠8只，本实验模型组存活率约50%（此存活率与文献报道相符[10]）。
2.2分组及干预
将成模大鼠随机分为模型组、益气化湿通络方组、贝那普利阳性对照组、假手术组共4组。益气化湿通络方组将颗粒剂［以大鼠与人药物剂量折算方法折算临床剂量2.76g/(kg·d)］溶于沸水按10mL/kg制成混悬液，放至室温后ig给药；贝那普利组ig贝那普利溶液［贝那普利片0.9mg/(kg·d)温开水溶解，按10mL/kg制成溶液）；假手术组和模型组ig等量温开水。造模成功分组后即开始给药，每天1次，连续12周。
2.3标本采集及检测
2.3.1标本采集12周给药结束后，3%戊巴比妥钠1.5mL/kgip麻醉大鼠，腹主动脉取血，分离血清用于相关指标检测；取大鼠左侧肾脏，部分放于10%福尔马林溶液，用于病理学指标检测，部分存储于?80℃冰箱，用于蛋白及基因表达检测。
2.3.2血生化指标测定用全自动血生化分析仪检测血Scr、血BUN水平。
2.3.3肾脏病理检测取福尔马林固定后的肾脏标本，石蜡包埋，制成3μm切片，经HE染色、天狼星红染色后，显微镜下观察肾组织病理改变。
2.3.4Westernblotting检测肾组织NF-κB、ICAM-1、TGF-β1和FN蛋白表达取少量肾组织，用含蛋白酶抑制剂和苯甲磺酰氟的溶解缓冲液进行匀浆。离心10min，取上清液作为蛋白提取液。提取总蛋白，用Bradford法进行浓度测定。取30μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后用微型蛋白质双凝胶电泳系统将其转移到硝化棉膜上。室温下用5%牛血清白蛋白（BSA）孵育RRED膜3h。一抗孵育过夜，然后二抗（抗体稀释1∶）室温孵育2h后，应用FusionFX5Spectra多功能成像系统（法国Viber公司）发光显色并拍照。采用QuantityOne分析软件对每个蛋白的含量进行灰度测定分析，每个条带重复3次。
2.3.5免疫组织化学法检测NF-κB、FN蛋白表达石蜡包埋的肾组织切片在二甲苯中分离，在不同浓度的乙醇中再水化。在柠檬酸缓冲液（pH6.0）中，92～95℃作用15min，进行微波抗原修复，高火1min，间歇1min，反复3次。冷却至室温，用PBS洗涤3次，每次5min。用8.3%H2O2浸泡20min。3次用PBS冲洗5min。然后在4℃下用一次抗体孵育一次，用PBS冲洗3次，5min。滴加二抗B放置30min，PBS洗3次，每次5min。用DAB显色，苏木素复染、封片。用光学显微镜对倍放大切片的显微照片进行图像分析。棕色区域为阳性，染色强度以积分吸光度值计算。
2.3.6荧光显微镜检测NF-κB在细胞核内的表达情况肾组织石蜡切片经脱蜡、梯度酒精复水后，抗原修复、漂洗、湿盒内封闭，一抗染色抗（NF-κB1∶）过夜。加荧光标记的二抗，防荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察拍照。
2.3.7实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测肾组织的FNmRNA表达按Trizol说明提取RNA，测定并计算RNA的浓度和纯度；取RNA在反转录酶的作用下合成cDNA，利用SYBR绿色PCR主混合物（TermoFisherSciencecInc.）进行实时PCR反应。PCR反应体系为SYBRbuffer（2×）25μL，上、下游引物各1μL，cDNA模板1μL，加灭菌蒸馏水至50μL。反应条件：94℃初始变性5min，94℃变性30s，58℃、30s，72℃延长15s。FN上游引物序列：5’-GGATCCCCTCCCAGAGAAGT-3’，下游引物序列：5’-GGGTGTGGAAGGGTAA-CCAG-3’，引物长度bp。检测荧光信号，得出Ct值，然后根据Ct值计算其相对表达量，实验重复3次。
2.4统计学方法
数据采用SPSS22.0统计软件进行分析，统计结果用表示，多组间的相关数据比较分析采用单因素方差分析。
3结果
3.1各组大鼠Scr、BUN的变化
结果见表1。与假手术组相比，模型组大鼠血清Scr、BUN水平明显增高（P＜0.05），提示模型组大鼠肾功能有一定的损伤。与模型组比较，各治疗组大鼠血清Scr、BUN水平均有一定程度的降低（P＜0.05）。
3.2各组大鼠肾组织病理改变比较
结果见图1。HE染色光镜下可见，假手术组大鼠肾小球结构清晰，体积正常。模型组大鼠肾小球系膜细胞增生，毛细血管壁增厚，肾小管基底膜增厚，部分肾小管上皮细胞呈空泡变性，核固缩，肾小球周围有大量炎症细胞浸润。各治疗组以上病变减轻。
天狼星红染色结果（图2）显示，假手术组没有明显红染，表明假手术组肾组织肾小球、肾小管结构较正常。模型组肾小球基底膜、系膜细胞外基质（ECM）的积累增加和肾小管扩张，弥漫性分布，肾小球、肾小管结构较紊乱。与模型组相比，药物治疗后红染减轻，肾小管、肾小球结构变清晰。
3.3各组大鼠肾组织NF-κB、ICAM-1、TGF-β1和FN蛋白表达的比较
Westernblotting结果见图3。与假手术组相比，模型组大鼠肾组织NF-κB、ICAM-1、TGF-β1和FN蛋白表达量明显增高（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组NF-κB、ICAM-1、TGF-β1和FN蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。
3.4免疫组化检测各组大鼠NF-κB、FN蛋白表达
免疫组化检测结果见图4。与假手术组比较，模型组大鼠肾组织NF-κB、FN蛋白呈棕*色小颗粒状，主要在肾小球中呈现阳性反应，NF-κB、FN蛋白表达量明显增高（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组NF-κB、FN蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。
3.5荧光检测NF-κB在细胞核内的表达
免疫荧光结果（图5）显示，标记NF-κB蛋白为红色荧光，DAPI染色细胞核为蓝色荧光。结果显示，假手术组几乎没有红色荧光表达；模型组红色荧光强度高，提示模型组NF-κB蛋白高表达；各治疗组细胞核中红色荧光强度较模型组稍降低，差异显著（P＜0.05）。
3.6各组大鼠肾组织FNmRNA表达的比较
结果见图6。与假手术组相比，模型组大鼠肾组织中FNmRNA表达量显著增高（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组FNmRNA表达量显著降低（P＜0.05）。
4讨论
CRF特点是炎症细胞浸润、趋化因子分泌、细胞外基质积累和肾组织损伤，肾纤维化是累进性肾脏损伤的最终途径，随后导致肾功能衰竭。5/6肾切除大鼠是一种典型的CRF模型，表现为进行性损伤，导致肾功能不全，并伴有明显的Scr和BUN异常。Scr和BUN反映肾脏从血液中清除肌酐并将其集中在尿液中的能力。病变受损的肾脏不能从血液中清除尿素，导致Scr、BUN升高。在本研究中，与假手术组比较，模型大鼠的Scr和BUN显著增加；HE、天狼星红染色病理观察到肾组织炎症细胞浸润，肾小球硬化和肾组织纤维化等病理表现，此模型很好地还原了所研究疾病的病程进展。
笔者以多年的临床经验归纳总结出，病患多以脾肾气虚、湿浊*淤蕴藉肾脏，瘀*阻络贯穿CRF所有病程阶段。针对此病机创制益气化湿、通络祛瘀的益气化湿通络方，临床疗效明显。本方由益气健脾补肾扶正的*芪、仙茅、仙灵脾为君药，促进CRF的进展中修复不足引起的各种症状，治疗补益久病引起的正虚阳虚等症。三焦分消祛湿邪的藿香、佩兰、陈皮、白豆蔻、土茯苓、积雪草，祛除在CRF的进展中炎症反应产生的各种刺激物引起的症状，
治疗湿浊*瘀内阻等症。泻浊瘀通肾络的当归、川芎、红花、地龙、水蛭，祛除CRF的进展中微循环障碍引起的各种肾脏病理损伤症状，治疗瘀血阻络表现的各种病症。本研究应用益气化湿通络方干预5/6肾切除大鼠模型，发现其能明显抑制肾组织炎症细胞浸润，改善肾功能，有效缓解肾小球硬化和肾组织纤维化等病理损伤进程，证实此方确有疗效。
越来越多的证据表明炎症和纤维反应在CRF的进展中起着重要的作用。CRF进程复杂，涉及多种细胞因子/趋化因子、黏附分子和生长因子[11-12]。NF-κB信号通路和促纤维细胞因子TGF-β1对肾功能衰竭的损害有重要作用[13-14]。目前大量报道提示炎症反应受NF-κB信号通路调节的影响，在静止的细胞中，NF-κB和IκB形成一个复合体，在细胞质中不起作用。当细胞受到细胞外炎症信号的刺激时，NF-κB二聚体的抑制蛋白k（inhibitorofNF-κBk，IκBk）失活导致IκB磷酸化，NF-κB核定位位点暴露，游离NF-κB与特异性IκB的快速易位诱导靶基因转录，促进靶细胞TNF-α、ICAM-1等的增殖，触发肾损害[15-16]。NF-κB增加巨噬细胞浸润，促进产生TGF-β1。TGF-β1增加纤维化和胶原合成，增加ECM在肾组织中的积累。同时，TGF-β1又可诱导NF-κB介导的肾炎症反应[17-19]。传统上，TGF-β1被认为是引起上皮间充质转化（EMT）的重要因子。EMT进一步诱导肾小管破坏和萎缩，导致肾小管退化。EMT的进展又调节TGF-β1、NF-κB、FN等因子使得CRF进入不断纤维化的进程中[20]。
FN是一种重要的ECM蛋白，在CRF中表达上调。它是一种相对分子质量的糖蛋白，与多种基质蛋白相互作用，并调节多种细胞过程。在生理上，FN在细胞黏附、细胞运动和组织修复中起着重要的作用[21]。病理上与NF-κB表达密切相关。NF-κB活化可以调控黏附分子ICAM-1、FN和其他ECM组分的过度表达，导致持续的炎症和肾脏损伤[22]。ICAM-1是表达于血管内皮细胞的跨膜糖蛋白，生理状态下负责细胞间黏附，病理刺激会引起激酶效应，招募白细胞等炎细胞聚集，产生促炎症反应[23]。如上述炎症反应又促进纤维化的进展，如此往复循环促成肾脏纤维化，肾功能恶化直至衰竭。本研究对炎症和纤维化相关细胞因子的表达进行了检测。以上研究结果所示，在模型组中，NF-κB、ICAM-1、TGF-β1和FN蛋白表达显著上调。经益气化湿通络方或贝那普利干预后可逆转肾组织以上蛋白的高表达，达到缓解CRF病情进展的治疗效果。为进一步探讨益气化湿通络方治疗肾功能衰竭的机制提供有力的实验依据。
综上所述，本研究结果证实5/6肾切除CRF大鼠模型存在炎症反应、肾纤维化及肾功能障碍。益气化湿通络方可减轻5/6肾切除大鼠肾炎症损伤及纤维化，改善肾功能。此疗效可能是通过抑制NF-κB信号通路介导的炎症反应和TGF-β1介导的纤维化进展起到的作用。本研究为益气化湿通络方治疗肾功能衰竭提供了分子生物学依据。
参考文献（略）
来源：朱晓婷，陈志强，张亚楠，李洁，延小丽，赵卓，李婷.益气化湿通络方通过调节NF-κB信号通路改善慢性肾功能衰竭大鼠炎性纤维化的实验研究[J].中草药,,51(8):-.
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